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N310全自動凱氏定氮儀廣泛用于各種食品、谷物、飼料等樣品的蛋白質(zhì)含量測定。此法又分為常量、半微量、微量法三種。其測定原理相同,主要區(qū)別在于常量法的樣品及試劑用量較微量法多。而微量法則具有實(shí)驗(yàn)規(guī)模小，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)。但微量法的準(zhǔn) 確度和精密度比常量法要差一些。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為半微量凱氏定氮法。凱氏定氮法整個測定過程分為消解、蒸餾、滴定三步。要使測定結(jié)果有更好的正確度、準(zhǔn)確度和精準(zhǔn)度,采用高效的方法和認(rèn)真細(xì)致掌握測定的每個步驟、各個細(xì)節(jié)及相應(yīng)的注意事項(xiàng),就顯得尤為重要。本文就此進(jìn)行深入的探討。

1. 原理 

蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。樣品與硫酸和催化劑一同加熱消化,使蛋白質(zhì)分解,分解生成的胺基與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離,用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù), 即為蛋白質(zhì)含量。

1.1 消化

有機(jī)物中的胺基在強(qiáng)熱和CuSO4、濃H2SO4作用下,消化生成(NH4)2SO4,反應(yīng)式為:2NH-2+ H2SO4+2H+=(NH4)2SO4(其中CuSO4做催化劑)

1.2 蒸餾

在凱氏定氮器中與堿作用,通過蒸餾釋放出NH3,收集于H3BO3溶液中,反應(yīng)式為:(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O 

1.3 滴定

用已知濃度的H2SO4 (或HCI)標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,根據(jù)H2SO4(或HCI)消耗的量計(jì)算出氮的含量,然后乘以相應(yīng)的換算因子,即得蛋白質(zhì)的含量,反應(yīng)式為: (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

依據(jù)凱氏定氮法,通過全自動凱氏定氮儀測定樣品中氮或粗蛋白的方法已得到廣泛的認(rèn)可和使用,以下是自動凱氏定氮儀測定魚粉和豆粕中粗蛋白含量的實(shí)驗(yàn)。

2. 實(shí)驗(yàn)過程

2.1主要試劑的配制40%氫氧化鈉:化學(xué)純400g氫氧化鈉溶于1000mL無氨蒸餾水中;2%硼酸:分析純20g硼酸溶于1000mL無氨蒸餾水中;0.1mol/L鹽酸:分析純8.3mL鹽酸定容至1000mL,通過無水碳酸鈉標(biāo)定;混合指示劑:把溶解于95%乙醇的0.%l溴甲酚綠溶液5份和溶于95%乙醇的0.1%l甲基紅溶液1份混合而成。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

N310全自動凱氏定氮儀;樣品消化爐DS-360石墨消解儀;廢氣吸收裝置。

2.3實(shí)驗(yàn)過程

稱取約0.2g樣品放入消解管,催化劑硫酸銅和硫酸鉀按1:15質(zhì)量比例混合加入3.2g,量取10mL左右濃硫酸慢慢搖動將樣品浸濕。放入DS-360石墨消解儀,通過曲線加熱升溫至420e,消化1h,樣品呈透明藍(lán)綠色液體,繼續(xù)消化20min消解完成。提升消煮管冷卻,消解的樣品放入格丹納N310全自動凱氏定氮儀,關(guān)閉安全門,設(shè)置參數(shù)后儀器自動進(jìn)行蒸餾、吸收、滴定、計(jì)算并打印結(jié)果。DS-360石墨消解儀的消解溫度設(shè)置如下:

(1)消化不易起泡的樣品,可選擇直線加熱,預(yù)加溫度設(shè)為380e,消化2h即可。

(2)若易起泡的樣品需采用曲線分段加熱

2.4測定結(jié)果

樣品測定結(jié)果見表1。

所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果達(dá)到分析要求,完全符合有關(guān)國標(biāo)GB/T6432-94。

3.實(shí)驗(yàn)過程注意事項(xiàng)討論

(1)樣品應(yīng)是均勻的。固體樣品應(yīng)預(yù)先研細(xì)混勻,液體樣品應(yīng)振搖或攪拌均勻。固體樣品一般取樣范圍為0.20~2.00g;半固體試樣一般取樣范圍為2.00~5.00g;液體樣品取樣10.0~25.0mL(約相當(dāng)?shù)?0~40mg)。若檢測液體樣品,結(jié)果以g/100mL表示。

(2)樣品放入定氮管內(nèi)時,不要沾附管頸上。

萬一沾附可用少量水沖下,以免樣品消化不完全,結(jié)果偏低,或者用濾紙包裹好一起投入消化,濾紙影響通過空白扣除。若樣品不易消化至澄清透明,可將消化液稍冷卻,加入數(shù)滴過氧化氫后,再繼續(xù)加熱消化至完全。

(3)消化時,不要用強(qiáng)火。應(yīng)注意消化溫度,用消解儀最好選擇曲線加熱,防止劇烈反應(yīng)導(dǎo)致樣品上沖附著在瓶壁上難以徹底消化。若樣品含糖高或含脂較多時,注意控制加熱溫度,以免大量泡沫噴出,造成樣品損失。可加入少量辛醇或液體石蠟,或硅消泡劑減少泡沫產(chǎn)生。在整個消化過程中保持和緩的沸騰,使火力集中在消化管底部,以免附著在壁上的蛋白質(zhì)在無硫酸存在的情況下,使氮有損失。采用格丹納公司消解爐DS-360石墨孔內(nèi)加熱,階段升溫能夠很好地解決此問題。

(4)如硫酸缺少,過多的硫酸鉀會引起氨的損失,這樣會形成硫酸氫鉀,而不與氨作用。因此,當(dāng)硫酸過多的被消耗或樣品中脂肪含量過高時,要增加硫酸的量;加入硫酸鉀的作用是升高溶液的沸點(diǎn);催化劑硫酸銅在有機(jī)物全部消化后,溶液顯清澈透明的藍(lán)綠色,可用它來指示消化終點(diǎn)。此外,硫酸銅還可用做下一步蒸餾時堿性反應(yīng)的指示劑。過氧化氫為氧化劑,有助于有機(jī)物消化,同時可以消除消化 過程中的氣泡現(xiàn)象。

(5)向消化管中加入濃堿時,往往出現(xiàn)褐色沉淀物,這是由于分解促進(jìn)堿與加入的硫酸銅反應(yīng),生成氫氧化銅,經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀。有時銅離子與氨作用,生成深藍(lán)色的結(jié)合[Cu(NH3)4]2+,加入氫氧化鈉是否足量,常常影響整個測定的順利進(jìn)行。由反應(yīng)原理可知,當(dāng)氫氧化鈉足量時有黑色氧化銅生成而使溶液呈淡黑色；當(dāng)氫氧化鈉量不足時就無黑色氧化銅產(chǎn)生而使溶液呈淡藍(lán)色,所以有無氧化銅顏色存在是判斷氫氧化鈉是否足量的標(biāo)志。

(6)實(shí)驗(yàn)過程中,因蒸餾時反應(yīng)室的壓力大于大氣壓力,故可將氨帶出。所以,蒸餾時,蒸氣要發(fā)生均勻,充足,蒸餾中不得停火斷氣,否則, 會發(fā)生倒吸。傳統(tǒng)凱氏實(shí)驗(yàn)中,停止蒸餾時,由于反應(yīng)室外層的壓力突然降低,可使液體倒吸入反應(yīng)室外層,所以,操作時,應(yīng)先將冷凝管下端提離液面并清洗管口,再蒸一分鐘后關(guān)掉熱源。蒸餾是否完全,可用精密pH試紙測冷凝管口的冷凝液來測定,中性則說明已蒸餾完全。一般情況下建議使用半微量法,因?yàn)槿绻麴s失敗的話,半微量法還可繼續(xù)蒸餾,而常量法只好全部重來,費(fèi)時費(fèi)力。

4.結(jié)論

凱氏定氮法作為目前的國標(biāo)方法與我們的工作密不可分,本文主要結(jié)合凱氏定氮儀測定樣品的具體實(shí)驗(yàn)討論了凱氏定氮法操作的細(xì)節(jié)及注意事項(xiàng);同時采用自動凱氏定氮儀法測定粗蛋白,操作簡單,快捷,高效,安全可靠,一次性可消化20個樣品,只需2~3h。蒸餾滴定一個樣品僅需5min左右便可得出結(jié)果,適用于批量樣品的測定。使用自動凱氏定氮儀測定氮及粗蛋白具有高的精密度和準(zhǔn)確性,對食品、飼料中的蛋白質(zhì)測定具有較強(qiáng)的實(shí)用性和可行性。